Cell重磅:中外團隊聯合發文,有望設計全新CAR-T療法
CPMMR · 2020/07/30
有望助力于設計全新的CAR-T療法。

2020年7月29日,北京大學醫學部精準醫療多組學研究中心黃超蘭團隊,中科院上海生化與細胞所許琛琦團隊、美國加州大學圣地亞哥分?;荻鞣驁F隊,聯手在Cell上發表了題為“Multiple signalingroles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy”的論文,該研究通過開發基于質譜的絕對定量蛋白質組新方法,揭示了T細胞受體-共受體(TCR-CD3)復合物酪氨酸在不同抗原刺激下的動態磷酸化修飾全貌,解析了不同CD3鏈ITAM結構域磷酸化特征的奧秘,從中發現了其中一條亞基CD3ε的單磷酸化新功能,有望助力于設計全新的CAR-T療法。


https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.07.018

TCR-CD3復合物在T細胞的發育、激活及對病原的免疫反應中起著決定性作用。這一重要作用來自于CD3鏈胞內端的免疫受體酪氨酸激活基序(Immunoreceptortyrosine-based activation motif-ITAM)。而ITAM的多樣性功能主要取決于其結構域的酪氨酸(Tyrosine)磷酸化,比如招募SYK激酶家族蛋白ZAP70進而激活下游的信號傳導。另外,ITAM的功能也被廣泛應用在對嵌合抗原受體(CAR)的研究中。其中CD3ζ亞鏈便常用于構建CAR-T細胞療法抗腫瘤活性,但其他CD3鏈的功能以及是否可應用于CAR的設計還有待進一步開發。

深入探索 CD3 ITAM的酪氨酸動態磷酸化模式可為全面理解不同CD3鏈的功能提供核心信息。TCR-CD3受體復合物有10個ITAM結構域分布著20個磷酸化位點,在時間分辨率下實現對全部磷酸化位點的同時定量分析在技術上極具挑戰性。

為了直觀比較不同TCR刺激下的磷酸化模式,精確繪制出TCR所有酪氨酸磷酸化的動態過程,黃超蘭團隊開發了一種新穎的絕對定量方法Targeted-IP-Multiplex-Light-Absolute-Quantitative Mass Spectrometry(TIMLAQ-MS)。該方法區別于目前報道的蛋白組絕對定量手段,不需要加入同位素重標的合成肽段,而是巧妙地利用串聯質量標簽(TMT),設計將6個標準樣品和4個分析樣品混合起來作為內標。標準樣品為不同濃度梯度的合成非重標磷酸化/非磷酸化CD3肽(A)和從未經抗原刺激的T細胞中通過IgG抗體免疫沉淀下來的背景蛋白(B)的混合物;用數據依賴采集(Data-dependent acquisition,DDA)結合平行反應監測(Parallel reaction monitoring, PRM)的方式獲得抗原刺激下,TCR-CD3免疫沉淀(IP)復合物中不同酪氨酸位點的磷酸化/非磷酸化在不同時間點的定量結果。TIMLAQ 成功繞過了以前的定量方法中通常使用的同位素重標記肽,既節約了成本,又有效降低了方法的復雜性和數據采集誤差,進一步提高了定量準確性,最終可完全實現在一次測量中對不同時間點全部ITAM磷酸化修飾的絕對定量,描繪TCR-CD3復合物的酪氨酸動態磷酸化修飾全貌。


基于TIMLAQ-MS法的CD3 ITAM磷酸化修飾鑒定

利用這一方法鑒定到在不同的TCR刺激條件下,CD3各亞基主要表現為雙磷酸化修飾模式,而唯獨CD3ε則呈現出單磷酸化修飾模式。此前研究表明,雙磷酸化的ITAM與激酶家族蛋白ZAP70有很強的結合而激活下游信號傳導,而單磷酸化的ITAM則表現出很低的結合性。新研究中的這一特殊的新發現驅使研究人員進一步深入探索CD3ε在TCR通路中的新潛在功能。結果顯示,單磷酸化的CD3ε可通過專門募集抑制性Csk激酶減弱TCR信號傳導,說明TCR中既有激活基元又有抑制基元,總體呈現為一種自制的信號傳導機制。作者團隊進一步深入研究,發現一旦將CD3ε細胞質結構域整合到第二代CAR中,CD3ε的ITAM結構域可以通過募集Csk減少CAR-T細胞因子的產生,而CD3ε的BRS結構域則可以通過募集p85促進CAR-T細胞的持久性??傮w而言,將CD3ε應用于CAR的設計可顯著提高CAR-T細胞的抗腫瘤活性。


黃超蘭教授


黃超蘭教授課題組

黃超蘭教授是北京大學醫學部精準醫療多組學研究中心主任,北京大學醫學部基礎醫學院長聘副教授,北京大學生命科學聯合中心研究員,曼徹斯特大學榮譽教授。近年來,黃超蘭教授帶領團隊積極開發基于質譜的蛋白質組學新方法,實驗室擁有國際領先的儀器、技術和方法,致力于為生物學和臨床研究中遇到的難題提供最有質量保證的全面蛋白質組和質譜技術手段。

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