Cell封面 | David Liu再取新突破:不需要做實驗,就能知道基因編輯的結果
iNature · 2020/07/27
不需要做實驗,就能知道基因編輯的結果。

本文轉載自“iNature”。

盡管堿基編輯器被廣泛用于目標點突變,但是決定堿基編輯結果的因素尚不十分清楚。

2020年7月23日,博德研究所David R. Liu團隊在Cell 在線發表題為“Determinants of Base Editing Outcomes from Target Library Analysis and Machine Learning”的研究論文,該研究在哺乳動物細胞中38,538個基因組整合靶標上表征了11個胞嘧啶和腺嘌呤堿基編輯器(CBE和ABE)的序列-活性關系,并使用所得結果訓練了BE-Hive,這是一種機器學習模型,可準確預測堿基編輯基因型結果(R ≈0.9)和效率(R≈0.7)。

研究人員以≥90%的準確度糾正了3388個與疾病相關的SNV,其中包括675個等位基因,其“旁觀者”核苷酸被BE-Hive正確預測,因此無法編輯。該研究發現了以前無法預測的C-to-G或C-to-A編輯的決定因素,并利用這些發現以≥90%的準確性糾正了174個病原性SNV的編碼序列。最后,該研究利用BE-Hive的見識來設計新穎的CBE變體,以調節編輯結果。這些發現啟發了堿基編輯,實現了以前難以處理的目標的編輯,并為新的基礎編輯器提供了改進的編輯功能。

另外,2020年7月8日,博德研究所David R. Liu及華盛頓大學醫學院Joseph D. Mougous共同通訊在Nature 在線發表題為“A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing”的研究論文,該研究描述了一種細菌間毒素,將其命名為DddA,它可以催化dsDNA中胞苷的脫氨。該研究設計了無毒且無活性的split-DddA半分子:DddA分割的一部分結構域(轉錄激活子樣效應子陣列蛋白)和尿嘧啶糖基化酶抑制劑的融合,產生了無RNA的DddA衍生的胞嘧啶堿基編輯器(DdCBE),可催化人mtDNA中的C?G到T?A轉化,具有高靶標特異性和產品純度。該研究使用DdCBEs建模人類細胞中與疾病相關的mtDNA突變,從而導致呼吸速率和氧化磷酸化的改變。不含CRISPR的DdCBE可以精確操縱mtDNA,而不是消除因被靶向核酸酶切割而產生的mtDNA拷貝,這對線粒體疾病的研究和潛在治療具有廣泛的意義。

2020年6月29日,博德研究所David Liu在Nature Biotechnology 在線發表題為“Programmable m6A modification of cellular RNAs with a Cas13-directed methyltransferase”的研究論文,該研究證明了具有截短的METTL3甲基轉移酶結構域或者是METTL3:METTL14甲基轉移酶復合物與核定位dCas13融合體,可以對細胞質RNA進行特異性m6A摻入,而前者的融合蛋白脫靶活性特別低??缍鄠€位點的獨立細胞測定法證實,這種靶向RNA甲基化(TRM)系統以高特異性介導了有效的m6A安裝在內源RNA轉錄物中。最后,該研究表明TRM可以誘導m6A介導的轉錄本豐度變化和選擇性剪接。這些發現將TRM確立為用于靶向轉錄組工程的工具,可以揭示單個m6A修飾的作用并分析其功能作用。

2020年6月22日,博德研究所David Liu團隊在Nature Biotechnology 在線發表題為“Genome editing with CRISPR–Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors”的綜述文章,該綜述首先描述已表征的Cas9和Cas12核酸酶的天然變異體,并詳細介紹具有擴大的靶向范圍和特異性的Cas9和Cas12核酸酶變異體的開發。接下來,該綜述討論堿基編輯器的開發和應用,這些編輯器可精確安裝點突變而無需雙鏈DNA斷裂(DSB)或供體DNA模板。最后,該綜述總結了新興的CRISPR–Cas基因組編輯工具,包括介導大片段DNA重排的Cas轉座子和重組酶,以及主要編輯器,它們以取代原始DNA序列的方式直接將編輯后的序列復制到目標DNA位點。


基因組DNA中靶向核苷酸的編輯是研究和治療應用的一項關鍵功能。單核苷酸變體(SNV)約占已知致病等位基因的一半,因此有針對性的點突變可以促進遺傳病的研究或潛在治療。以前,研究人員開發了胞嘧啶堿基編輯器(CBE)和腺嘌呤堿基編輯器(ABE),它們共同實現了所有四個過渡點突變的靶向(C→T,T→C,A→G ,以及G→A),并具有較高的期望取代率與不期望的插入和缺失(indels)比率。

堿基編輯的實用性啟發了具有不同屬性的堿基編輯器變體的開發。迄今為止,通過分析少量基因組位點的編輯結果來收集這些屬性,通常選擇這些位點與先前的基因組編輯研究相一致。但是,堿基編輯器和目標序列之間的相互作用會以復雜的,有時是不直觀的方式影響編輯結果。結果,獲得具有所需效率的所需基因型通常需要對每個靶標進行堿基編輯和單向導RNA(sgRNA)選擇的經驗優化。

某些不適合用于堿基編輯的規范準則的可行目標可能會被忽略,因為用于目標選擇的簡單準則無法完全捕獲堿基編輯的范圍。對堿基編輯的序列和脫氨酶決定因素進行系統,全面的分析將增強我們對堿基編輯器的理解,促進它們在精確編輯應用程序中的使用,并指導新的堿基編輯器的開發。


文章模式圖(圖源自Cell )

在這項研究中,研究人員開發了包含38,538對sgRNA和靶序列對的文庫,并將它們整合到三種哺乳動物細胞類型的基因組中,以全面表征8種流行CBE和ABE的堿基編輯結果和序列-活性關系。研究人員分析了脫氨酶,序列背景和細胞類型在確定堿基編輯產生的基因型中的作用,并開發了一種機器學習模型,可以在任何目標位置準確預測堿基編輯結果,包括許多以前不可預測的特征。

利用所得信息,研究人員應用了各種堿基編輯器(包括新近設計的變體),將3388個與疾病相關的SNV的基因型和2399個編碼序列準確地校正為野生型(≥90%的精度),包括通過非規范的堿基編輯結果。這些發現大大擴展了我們對堿基編輯的理解,并揭示了新的和先前描述的堿基編輯器的新功能。

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