AAV載體構建莫發愁,金唯智Hi-Fi技術為你解憂!
金唯智 · 6天前
GENEWIZ開發了一套針對rAAV質粒構建、錯誤ITR的修復和rAAV質粒大量制備的方法——Hi-Fi技術,不僅制定了更簡單、靈活和快速的克隆方案,而更重要的是發明了一種特殊的大腸桿菌細胞及其配套使用的AAV穩定劑。


一.背景介紹

基因治療(Gene Therapy)是指將外源基因導入靶細胞,以糾正或補償因基因缺陷或基因表達異常引起的疾病。腺相關病毒(AAV)作為基因治療的一種明星載體,對于人類攻克癌癥或更多的重大疾病有著巨大的潛力。

為產生重組腺相關病毒(rAAV),哺乳動物或昆蟲細胞通常需要共轉染兩個或者三個質?!渲幸粋€或兩個質粒提供AAV包裝復制元件和腺病毒輔助元件,另外一個質粒(AAV質粒)包含兩端帶有ITR序列的目的基因表達框。


圖1:AAV病毒基因組結構(圖片來源:參考資料[1])

AAV質粒中ITR區域的完整性對rAAV的產生至關重要。缺失突變的ITRs會降低完整AAV病毒的產量,增加非目的DNA包裝的產生1。然而,在使用大腸桿菌進行質粒擴增過程中,AAV質粒的ITR區域經常發生突變。研究表明,ITR序列的不同區段(A-A’ region,B-B ’region, C-C’ region以及D region)缺失,都會對rAAV的產生造成影響。對AAV質粒的ITR序列進行準確的分析將會對rAAV的質控具有重要的意義。


圖2:AAV2的ITR序列的示意圖。ITR由兩個臂回文(B-B'和C-C')和一個長莖回文(A-A')組成。D序列在AAV基因組的每一端只出現一次。

二.面臨挑戰

目前,rAAV質粒主要在細菌中擴增。然而,由于細菌中同源重組系統,ITRs經常發生重排。細菌繁殖后,rAAV質粒中最常見的突變之一是ITR的B-B’或C-C’臂缺失(圖2)。這種缺失使T型ITR發夾的莖更長,比野生型ITR更加穩定。


圖3:AAV2的ITR區域中B-B’臂缺失的示意圖。野生型AAV2的ITR區域是一個125bp的T型發夾結構,而缺失突變的ITR是一個103bp的發夾結構,其莖部更長。

針對ITR易缺失的特性,科學家們一直努力尋找能使rAAV質粒的ITR在細菌中保持穩定擴增的方法,現在市場上使用較多的方法是通過使用特殊的大腸桿菌細胞來保持其穩定。市場上目前反饋比較好的,有來源于I公司的S13和S14,它被設計為專門克隆不穩定基因(如包括有正向重復的慢病毒DNA),還有很多客戶根據在多年AAV方面研究的經驗,也會使用B83 (來源于A公司)、D10(來源于I公司)和S2(來源于A公司)等大腸桿菌細胞。

GENEWIZ通過專利的ITR測序方法(該方法可以測通野生型ITR序列以及更有挑戰性的缺失突變的ITR序列,能幫助定性評估ITR區域甚至是缺失突變ITR區域的完整性)和大量的rAAV質粒構建經驗,發現這些細胞的效能也是有限的,并不能普遍穩定不同的rAAV質粒(表1)。

三.解決方案

為此,GENEWIZ開發了一套針對rAAV質粒構建、錯誤ITR的修復和rAAV質粒大量制備的方法——Hi-Fi技術,該方法的核心點不僅僅是制定了更簡單、靈活和快速的克隆方案,而更重要的是發明了一種特殊的大腸桿菌細胞及其配套使用的AAV穩定劑,較現有的方法更能使rAAV質粒的ITR在細菌中擴增過程中保持穩定,不易再發生缺失(表1)。

表1:5個隨機AAV構建后ITR的正確性


基于感受態細胞的對比數據,我們進一步探索了Hi-Fi技術流程在轉化篩選正確克隆過程中的能力。由于ITR本身的不穩定性,在質粒構建的過程中,會有發生突變的可能性。

原始質粒:


第一次轉化結果:


目前金唯智基于Hi-Fi技術可以提供rAAV的質粒構建,ITR區域的修復和rAAV質粒大量制備以及AAV病毒包裝等相關服務。

四.技術流程

01 AAV載體構建


02 ITR區域修復


五.金唯智rAAV的質粒構建具有以下特點

● 先進的合成技術:可以合成高難度重復序列,高GC含量的困難序列以及含有發夾結構的ITR區域。

● 質量可靠:酶切和測序雙重檢測,金唯智自主研發的ITR測序技術能夠測通ITR區域,確保序列100%正確。

● 免費的表達系統優化:可以根據表達系統對目的基因進行密碼子優化。

● 周期短:rAAV-ITR載體構建最快僅需8-12天;

● 完善的服務流程:可以提供從基因合成,載體構建到病毒包裝的一站式服務。


圖4 AAV2載體

六.交付標準

AAV-ITR構建、修復,滿足:

  ● ITR區域測序并確保正確;

  ● 2-5 ug;

AAV-ITR大抽,滿足:

  ● ITR區域測序并確保正確;

升級服務:

  ● ≥90%超螺旋,內毒素≤10EU/mg;

  ● ug-g級別的發貨量;

  ● 0.22um過濾除菌;

注:因為涉及到技術機密,相應的菌株暫時不會發貨給客戶

七.案例分享

項目類型:Hi-Fi 技術構建 rAAV 載體

目的基因以及ITR區域合成之后,構建AAV載體之后,再利用Smal酶進行酶切后,驗證條帶大小。


圖5: 酶切圖,L1: undigested;L2: digested with Smal and BsrGI;L3: ladder 5000

條帶大小正確后,再利用sanger測序技術,測定目的基因和ITR區域序列:


圖6:ITR區域測序圖

上圖可以看出,Sanger測序驗證了rAAV左右兩側的ITR區域序列正確。從而確保rAAV載體構建正確。

項目類型:Hi-Fi技術修復ITR序列

AAV原始質粒ITR缺失突變,常規PCR擴增很難直接完成序列修復,金唯智通過特定修復方案及Hi-Fi技術流程,成功交付多例修復質粒。


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